Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини / Щербак Н.Л. та ін. 2015

Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини

Щербак Н.Л., Василенко М.Ю., Кучук М.В.

Колаген I типу є важливим сировинним матеріалом для цілого ряду напрямків фармацевтичного виробництва і використовується як хірургічний шовный матеріал, як допоміжна речовина в технології мазей, супозиторіїв, розчинів для ін’єкцій, очних лікарських плівок та ін. Технологія отримання рекомбінантного колагену дозволила отримувати більш однорідний та безпечний колаген.

Рис. 1. Схематичне зображення Т-ДНК бінарних векторів pCB210 та рСВ226: 35Spro – промотор вірусу мозаїки цвітної капусти; nospro – промотор нопалін синтази; nost – термінатор нопалін синтази; oсst – термінатор октопін синтази; bar – ген фосфінотрицин – N – ацетилтрансферази, Р4Н-α та Р4Н-β гени α- та β-субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилаза

Метою нашої роботи було створення трансгенних рослин N. benthamiana – адаптованих продуцентів для транзієнтної експресії колагену людини, в яких відбувається пост-трансляційна модифікація цього рекомбінантного білка. завдяки перенесенню в геном цих рослин послідовностей, що кодують фермент проліл-4-гідроксилазу та експресії цього ферменту, стає можливим гідроксилювання залишків проліну в молекулі колагену, що в свою чергу забезпечує утворення коректної просторової структури полімерного колагену.

Рослини N. benthamiana є модельним об’єктом для синтезу рекомбінантних білків, тому для проведення досліджень, щодо експресії генів колагену людини І-го типу, був вибраний саме цей вид. Гідроксилювання залишків проліну в молекулі колагену є необхідною складовою процесу дозрівання молекули колагену в людському організмі, отже наявність ферменту проліл-4-гідроксилази людини в клітинах N. benthamiana є вкрай важливим фактором для коректного формування молекули колагену. Створення трансгенних рослин N. benthamiana, які мають у своїх клітинах проліл-4-гідроксилазну активність, дає можливість отримати адаптовані продуценти для синтезу колагену в рослинній системі.

Для створення рослин N. benthamiana із гідроксилазною активністю за людським типом було проведено клонування генів α- та β-субодиниці ферменту (P4H- α та P4H- β) за допомогою ПЛР та створення генетичних конструкцій для трансформації рослин. Для проведення генетичної трансформації ми використовували суміш суспензій двох агробактеріальних культур, кожна з якої містила відповідний вектор.

В обох векторах, рСВ210 та рСВ226, для селекції рослин був використаний ген bar, що надає трансгенним рослинам стійкість до гербіциду фосфінотрицину. В умовах такої селекції, приблизно 30  % трансгенних рослин мали в своєму геномі послідовності обох субодиниць проліл-4-гідроксилази. На рисунку 2-г видно відсутність відповідного сигналу після проведення ПЛР (доріжки 4, 5), що свідчить про відсутність гена P4H-β в геномі цих рослин, тоді як наявність гена P4H-α в них підтверджується (рис. 2-б). Вкорінені рослини, в геномі яких за допомогою ПЛР було підтверджено наявність обох субодиниць проліл-4-гідроксилази, переносили в ґрунт в умовах теплиці. Перенесені в ґрунт

Рис. 2. Результати генетичної трансформації N. benthamiana векторами рСВ210 та рСВ226: а – регенерація рослин N. benthamiana на селективному середовищі; б–в – електрофореграмма результатів ПЛР аналізу тотальної ДНК рослин N. benthamiana, відібраних на селективному середовищі з використанням праймерів до bar (в), P4H-α (α) та P4H-β (г) генів: М – маркер 1 kb Plus DNa Ladder (Gibco BrL); К – негативний контроль, ДНК нетрансформованої рослини; К+ – позитивний контроль ДНК плазміди рСВ210 або рСВ226; 1–5 – ДНК рослин-регенерантів, стійких до фосфінотрицину

Висновки

Були створені генетичні конструкції для агробактеріальної трансформаціі, які містять генетичні послідовності α- та β-субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази, проведено генетичну трансформацію рослин N.benthamiana. В результаті були отримані трансгенні рослини N. benthamiana, що містять гени α- та β-субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази, наявність яких в геномі підтверджена за допомогою ПЛР. Ми вважаємо, що такі рослини можуть бути використані, як адаптовані продуценти, в яких забезпечується пост-трансляційна модифікація ланцюгів колагену, а саме гідроксилювання залишків проліну, що синтезуються транзієнтно.

Джерела

• Щербак Н.Л., Василенко М.Ю., Кучук М.В. Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини // Фактори експериментальної еволюції органiзмiв: Зб. наук. пр. / Національна академія наук України, Інститут молекулярної біології і генетикп, Укр. Т-во генетиків і селекціонерів iм. М.I. Вавилова; редкол. / В. А. Кунах (голов. ред.) [та iн.] – К.: Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова, 2015. – Т. 17. – С. 265-269
• Доклад на X Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов»