НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

СИТНИК
Катерина Сергіївна

УДК 577.21 + 582.926 + 581.174

РОЗРОБКА МОДЕЛЬНОЇ СИСТЕМИ ОТРИМАННЯ 
ТРАНСПЛАСТОМНИХ  РОСЛИН НА  ПРИКЛАДІ
  ПРЕДСТАВНИКІВ РОДИНИ ПАСЛЬОНОВИХ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат 
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі генетичної інженерії Інституту клітинної біології 
та генетичної інженерії Національної Академії Наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук Кучук Микола Вікторович, 
                                      Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН 
                                      України, заст. завідуючого відділу генетичної інженерії

Офіційні опоненти:  доктор біологічних наук Галкін Анатолій Павлович,
                              Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,
                              завідуючий відділу біоінженерії 

                                      доктор біологічних наук, професор 
                                       Головко Ераст Анатолійович, Національний ботанічний сад 
                                       ім. М.М. Гришка НАН України завідуючий відділу алелопатії 

Провідна установа:   Інститут фізіології рослин і генетики НАН України.

Захист відбудеться    24          грудня                   2004 р. о     14     годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано     19      листопада    2004р.

Вчений секретар                                                                        
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук                                                                  О.А. Кравець 
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Генетично змінені рослини вже багато років використовуються для вивчення фундаментальних питань функціонування рослинного організму та знаходять практичне застосування в різноманітних галузях господарської діяльності людини: сільському господарстві, медицині, фармацевтиці та інших. Генетична трансформація пластидної ДНК є відносно новою технологією, що має ряд переваг порівняно з ядерною трансформацією. Розвиток цієї галузі біотехнології рослин в перспективі може привести до її широкого застосовування для створення систем накопичення корисних білків; їстівних вакцин; рослин, стійких до біотичних та абіотичних факторів. На сьогодні вже є повідомлення про вбудовування в пластом тютюну генів синтезу соматотропіну (Staub et al., 2000), сироваткового альбуміну людини, інсуліну, холерного токсину (Daniell, 2001; Daniell, Dhingra, 2002 ), біополімерів, що підлягають біодеградації (Guda, 2000), стійкості до посухи (Daniell et al., 2001), комах (Kota et al., 1999; De Cosa et al.,  2001), грибів (DeGray et al., 2001), гербіцидів (Daniell et al., 1998; Lutz, 2001). Хлоропластні трансформанти отримані для двох видів сільськогосподарсько-важливих рослин: картоплі (Sidorov et al., 1999) та томату (Ruf et al., 2001). Крім того, хлоропластна трансформація є зручним інструментом для досліджень функцій хлоропластних генів, механізмів регулювання експресії, впливу ядерних генів на функціонування пластому.
Хлоропластна трансформація має ряд особливостей, які обумовлюють підвищений інтерес до цієї технології (Bock, 2001): поліцистронний тип експресії дозволяє вводити одразу декілька генів в одній трансформаційній системі (Staub, Maliga, 1995); багатокопійність хлоропластного геному приводить до накопичення великої кількості білку (De Cosa et al., 2001; Daniell et al., 1998); материнський тип успадкування пластид зменшує ризик розповсюдження трансгенів в оточуючому середовищі (Daniell, 1999); наявність в хлоропластах механізму гомологічної рекомбінації дає змогу вбудовувати трансген у визначене місце пластому (Camerini-Otero, 1995).
У той же час, кількість об’єктів, для яких здійснена хлоропластна трансформація, досі є дуже малою і включає, в основному, модельні види. Рутинні, ефективні, відтворювані методики отримання транспластомних рослин існують лише для тютюну. У нашій роботі запропоновано новий підхід до здійснення хлоропластної трансформації. Він базується на таких технологіях: висока ефективність регенерації та генетичної трансформації рослин N. tabacum; наявність відтворюваних методик отримання фертильних транспластомних рослин N. tabacum; можливість створення цитоплазматичних гібридів рослин, що об’єднують цитоплазму одного виду та ядро іншого. 
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках фундаментальних науково-дослідних робіт відділу генетичної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ: “Вивчення молеулярно-біологічних і генетичних процесів в реконструйованих трансгеномних і трансгенних клітинних лініях і рослинах” (1995 – 1999 рр.; не реєструвалася); “Дослідження біологічних процесів в генетично модифікованих рослинах” (2000 – 2004 рр.; номер держреєстрації 0101и000390).
Патент: Kuchuk N.V. Methods for transforming plant plastids and making transplastomic plants. U.S. Patent Application No. 60/191,147, International patent application No: PCT/US01/09318, WO01/70939. International publication date 27 September 2001.
Мета і завдання роботи. Метою роботи було отримати і виконати молекулярно-біологічний аналіз хлоропластних трансформантів рослин Nicotiana tabacum Wiskonsin, Nicotiana tabacum       (+ Salpiglossis sinuata), Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis), Nicotiana tabacum (+ Lycium barbarum),  Nicotiana tabacum (+ Atropa belladonna) та застосувати їх в експериментах із соматичної гібридизації з рослинами Salpiglossis sinuata та Lycium barbarum.
В завдання роботи входило:
1) отримати транспластомні цибридні рослини Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata), Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis), Nicotiana tabacum (+ Lycium barbarum) та Nicotiana tabacum (+ Atropa belladonna);
2) отримати транспластомні рослини Salpiglossis sinuata шляхом соматичної гібридизації рослин дикого типу з трансформованими цибридними рослинами Nicotiana tabacum (+  Salpiglossis sinuata);
3) вивчити ядерну та мітохондріальну організацію транспластомних рослин Salpiglossis sinuata, отриманих шляхом соматичної гібридизації диких форм з трансформованими цибридними рослинами Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata);
4) отримати транспластомні рослини Nicotiana tabacum з експресією репортерного гену uidA (ген -глюкуронідази) для використання в експериментах із соматичної гібридизації;
5) провести соматичну гібридизацію між рослинами Lycium barbarum дикого типу та хлоропластним трансформантом Nicotiana tabacum і дослідити експресію гена uidA.
Об’єкти дослідження - генетична інженерія пластидної ДНК. 
Предмет дослідження – отримання, морфологічний та молекулярно-біологічний аналізи хлоропластних трансформантів та соматичних гібридів.
Методи дослідження - метод генетичної трансформації пластому шляхом прямого перенесення трансгенів в протопласти за допомогою поліетиленгліколя (ПЕГ), метод соматичної гібридизації рослинних клітин, методи аналізу отриманих в результаті трансформації та соматичної гібридизації рослин (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), дослідження рестриктних спектрів хлоропластної та мітохондріальної ДНК, вивчення множинних молекулярних форм ферментів  амілази та  естерази, тест на активність гена -глюкуронідази).
Наукова новизна.
•	Запропоновано новий ефективний підхід до отримання транспластомних рослин для видів, що мають низький трансформаційний та регенераційний потенціал.
•	Вперше отримано трансформовані пластоми рослин Salpiglossis sinuata,  Scopolia carniolica, Physochlaine officinalis.
•	Вперше здійснено генетичну трансформацію пластомів, що функціонують в клітинах іншого виду.
•	Здійснено соматичну гібридизацію між рослинами Lycium barbarum та транспластомними рослинами Nicotiana tabacum.
Практичне значення одержаних результатів. Технологія пластидної трансформації дозволяє створювати рослини з новими властивостями для використання їх у різноманітних галузях промислової діяльності, зокрема в сільському господарстві та фармацевтиці. Багато сільськогосподарсько-важливих рослин є рослинами з низьким регенераційним та трансформаційним потенціалом, що робить їх проблемними з точки зору роботи в культурі in vitro та проведенні генетичної трансформації. Підхід, запропонований у роботі, дозволяє підвищувати ефективність хлоропластної трансформації рослин з низьким трансформаційним та регенераційним потенціалом. 
Підхід також передбачає можливість перенесення за допомогою соматичної гібридизації трансформованих пластид до інших, корисних, види, ядра яких є сумісними з даним трансформованим пластомом. Створення за допомогою хлоропластної трансформації маркованих пластомів та їх перенесення до інших видів є зручними системами для вивчення ядерно-цитоплазматичних взаємовідносин. 
Рослини Lycium barbarum, які мають їстівні плоди, обрані як об’єкт для дослідження експресії репортерного гена uidA в різних типах пластид, зокрема в хромопластах, через потенційну можливість використання рослин Lycium barbarum для створення їстівних вакцин. Їстівні вакцини з часом можуть стати альтернативним, більш дешевим та зручним, способом виробництва та споживання вакцин. 
Можливість використання запропонованого підходу показана в роботі на прикладі модельних та диких представників видів родини пасльонових. В подальшому планується його застосування для корисних видів з цієї родини та з інших родин. 
Особистий внесок здобувача. Автором особисто були розроблені завдання досліджень, сплановані та проведені всі експерименти. Особистий внесок здобувача  полягає також в обробці та інтерпретації результатів роботи, аналізі літератури, написанні наукових статей. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок та концепцію досліджень, основні ідеї роботи, структуру дисертаційної роботи, проведено вибір об’єктів. Векторні конструкції були люб’язно надані професором Коопом (Інститут Ботаніки, Мюнхенський Університет, Німеччина). Молекулярно-біологічні аналізи з використанням полімеразної ланцюгової реакції та дослідження рестриктних спектрів проведені за допомогою к.б.н. Комарницького І.К. (ІКБГІ НАНУ), аналіз множинних молекулярних форм ферментів виконано нс Черепом М.Н. (ІКБГІ НАНУ). 
Апробація роботи. Результати досліджень доповідалися на 2 – гій міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений”, Харків, 2003; IV Міжнародній конференції “Геном растений”, Одеса, 2003; Всеросійській науково-практичній конференції молодих вчених “Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке”, Санкт-Петербург, 2001; Міжнародному симпозіумі “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология”, Москва, 2001; Міжнародній конференції “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources”, Ялта, 2002;  Конференції молодих вчених “Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics”, Київ, 2003.
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 8 наукових робіт, у тому числі 3 статті в провідних наукових журналах.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступної частини, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків і списку літератури, що містить 148 посилань. Робота викладена на 120 сторінках, включає 9 таблиць та 35 рисунків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Рослинний матеріал. Цибридні рослини Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis), Nicotiana tabacum (+ Lycium barbarum) (Babijchuk et al., 1995) та Nicotiana tabacum (+ Atropa belladonna) (Kushnir et al., 1987) були отримані раніше в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ. Асептичні рослини Salpiglossis sinuata, Lycium barbarum та Nicotiana tabacum зберігаються в колекції ІКБГІ НАНУ. Цибридна рослина Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) отримана  Than N.D. et al., 1988 та люб’язно надана проф. Медееши (Сегедський Біологічний центр, Угорщина). Усі рослини вирощували в стерильних умовах при 16-годинному світловому дні на безгормональному середовищі МS (Murashige, Skoog, 1962), розмножували живцюванням. Для експериментів використовували рослини 3 - 5 тижневого віку.
Векторні конструкції та бактеріальні штами. Плазмідні векторні конструкції pCB033 та pICF584 були люб’язно надані проф. H.-U. Koop (Інститут Ботаніки, Мюнхенський Університет, Німеччина). Для ампліфікації плазмід використовували клітини Escherichia coli, штам XL-Blue. Для відбору бактерій плазміди несуть ген стійкості до ампіциліну. 
Плазміда pCB033 містить ген aadA (аміноглікозид 3`- аденілінтрансфераза), що знаходиться під контролем промотору 16S рДНК тютюну та має термінатор гена rbc (велика субодиниця рибулозо-1,5-бісфосфат-карбоксилази) з пластому Chlamydomonas reinhardii. Селективний ген оточений  генами rpl32 (рибосомальний білок) і trnL (тРНК лейцину) малої унікальної ділянки тютюнового пластому, що забезпечує вбудовування гена aadA у визначену ділянку хлоропластного геному. Плазміда pICF584 містить, крім селективного гена aadA, репортерний ген uidA (ген -глюкуронідази). Гени знаходяться між послідовностями psbA (D1 білок фотосистеми ІІ) і trnH (тРНК гістидину) великої унікальної області пластома тютюну.
Виділення і культивування протопластів. В усіх експериментах використовували протопласти тканин листка. Листя ферментували в розчинах, що містили різні концентрації ферментів Cellulase Onozuka R-10, Macerosim R-10 та Cellulisin. Виділяли фракцію живих протопластів і культивували в рідкому середовищі KM8p (Kao, Michayluk, 1975). Для регенерації рослин тютюну, цибридів з ядром тютюну та колоній, отриманих в результаті соматичної гібридизації Lycium barbarum та Nicotiana tabacum використовували 1 мг/л БАП                                   (6-бензиламінопурин) і 0,1 мг/л НОК (-нафтилоцтова кислота). Для регенерації рослин S. sinuata замість БАП додавали 1 мг/л зеатину. 
Генетична трансформація та соматична гібридизація. Плазмідну ДНК для проведення експериментів виділяли з нічної культури Escherichia coli, використовуючи набір Qiagen tip 500 (Qiagen, Hilden, Germany) для виділення ДНК відповідно інструкціям до нього. Трансформацію проводили, як описано в статті Koop et al., 1996, з деякими модифікаціями. Перед проведенням соматичної гібридизації рослини – донори хлоропластів опромінювали  -променями в дозі 500 – 600 Гр (джерело - Со60, 0,1 Гр/сек). Соматичну гібридизацію здійснювали відповідно методиці Menczel et al., 1981 з незначними модифікаціями. 
Молекулярно-біологічний аналіз отриманих рослин. Аналіз рослин, отриманих у результаті генетичної трансформації проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції використовуючи праймери, специфічні до селективного гена aadA, репортерного гена uidA та до ділянок хлоропластної ДНК. Для аналізів використовували тотальну рослинну ДНК, яку виділяли згідно протоколу Cheung et al., 1993. Аналіз ділянок хлоропластної, мітохондріальної та ядерної ДНК рослин, отриманих у результаті соматичної гібридизації виконували, досліджуючи спектри фрагментів, синтезованих за допомогою ПЛР та одержаних в результаті обробки синтезованих фрагментів ендонуклеазами рестрикції. Ядерну природу гібридних рослин вивчали, також, порівнюючи множинні молекулярні форми естераз та амілаз. Для виконання аналізів використовували методики, прийняті в нашому Інституті (Биохимический анализ в клеточной биологии растений. – Киев. – 1988. – Препринт /АН УССР, Институт ботаники, 88.1). Активність репортерного гена uidA в трансгенних пластидах виявляли, проводячи гістохімічну реакцію за Jefferson (1987).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Загальна концепція роботи. Ефективність трансформації рослинного організму завжди залежить від ефективності та імовірності двох процесів: вбудовування трансгену в рослинну ДНК та регенерації трансформованої клітини. Регенераційна здатність рослинної клітини залежить від багатьох причин: ступеня її диференційованості, типу тканини, ендогенного гормонального балансу, виду, зовнішніх умов, складу живильного середовища, екзогенних гормонів тощо. В усіх дослідженнях з хлоропластної трансформації відмічалося, що однією з головних передумов, необхідних для отримання трансформантів, є розробка ефективної системи регенерації (Bock, 2001; Sidorov et al., 1999; Ruf et al., 2001). Отже, наявність високорегенераційної системи культивування експлантів є одним з вирішальних факторів для здійснення стабільної пластидної трансформації. 
Тютюн, модельна рослина біотехнологів рослин, є єдиним видом для якого розроблена ефективна та відтворювана методика хлоропластної трансформації (Kanevski et al., 1999; Rochaix, 1997; Hager et al., 1999; Kofer et al., 1998; Eibl et al., 1999; Bock, 2001; Staub, Maliga, 1995). Безумовно, однією з причин цього є висока регенераційна та трансформаційна здатність тютюну. 

тютюн

рослина 1

соматична гібридизація

отримання рослини з ядром тютюну та
хлоропластами рослини 1

генетична трансформація 

отримання транспластомної цибридної рослини  з трансгенними хлоропластами рослини 1

перенесення трансгенних хлоропластів  в рослину 1

перенесення трансгенних хлоропластів  в рослину 2

+

Виходячи з вищесказаного ми вирішили запропонувати та розробити новий підхід до здійснення хлоропластної трансформації. Він полягає у поєднанні за допомогою технології соматичної гібридизації в одній клітині органел тютюну з органелами інших видів. Імовірно, за регенераційну здатність рослинного організму відповідає генетична інформація, закодована в ядерній ДНК, отже цибридні рослини з ядром тютюну та хлоропластами інших видів будуть мати високу регенераційну здатність. Разом з тим, під час трансформації цих рослин трансген, оточений гомологічними послідовностями пластидної ДНК, має вбудовуватися в хлоропластну ДНК того виду, пластиди якого знаходяться в цибридній клітині. Потім трансгенні хлоропласти можна переносити з цибридних рослин або до клітин того ж виду, до якого належать і хлоропласти, або до клітин іншого виду. Експерименти, необхідні для виконання запропонованого підходу схематично представлені на рисунку 1. 

Рис.1. Cхема експериментів з отримання транспластомних рослин.

Рослина 1 на рис.1 може бути будь-якою, але такою, хлоропласти якої сумісні з ядром тютюну. Рослина 2 повинна мати ядро, що є сумісним з хлоропластами рослини 1. 
Таким чином здійснюється трансформація хлоропластів тих видів, які цікавлять дослідника, але мають низький трансформаційний та регенераційний потенціал, а клітини тютюну є посередниками, в яких знаходяться хлоропласти, що цікавлять. Ще одним шляхом виконання запропонованого підходу є отримання хлоропластних трансформантів тютюну та перенесення трансгенних хлоропластів тютюну з клітин тютюну до клітин інших видів. 
Генетична трансформація пластомів цибридних рослин. Для розробки нашого підходу ми використали раніше отримані цибридні рослини (див. матеріали і методи). Трансформацію проводили векторною конструкцією pCB033. Після проведення генетичної трансформації зелені колонії відбирали на регенераційному середовищі MS з селективними агентами (300 - 400 мг/л спектиноміцину або 200 мг/л спектиноміцину та 200 мг/л стрептоміцину). Результати оцінки ефективності трансформації наведені в таблиці 1. Аналіз отриманих рослин виконували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Результати аналізу представлені на рисунку 2.

Таблиця 1.
Ефективність трансформації пластомів цибридних рослин.
Цибридна рослина	Кількість експериментів	Кількість стійких клонів	Кількість трансформованих клонів	
Nicotiana tabacum                                 (+ Physochlaine officinalis)	4	1	1	
Nicotiana tabacum                                 (+ Salpiglossis sinuata)	2	2	2	
Nicotiana tabacum                                     (+ Lycium barbarum)	2	1	0	
Nicotiana tabacum                                    (+ Scopolia carniolica)	2	2	2	
Nicotiana tabacum
(+ Atropa belladonna)	1	1	0	

Рис. 2. Результати ПЛР-аналізу трансформованих цибридних рослин.

2000

1000

1

2

3

4

5

6

1 - 1 Kb Plus DNA Ladder (Gibco); 2- позитивний контроль, ДНК транспластомної рослини N. tabacum; 3 - N. tabacum        (+ S. carniolica); 4 - N. tabacum (+ S. sinuata); 5 - N. tabacum       (+ Ph. officinalis); 6 -  негативний контроль, ДНК нетрансформованої рослини N. tabacum.

       

Транспластомні рослини Salpiglossis sinuata. Наступним етапом роботи було повернення за допомогою соматичної гібридизації трансгенних хлоропластів з цибридної рослини N. tabacum              (+ S. sinuata) в клітини S. sinuata дикого типу. 
Після злиття протопластів транспластомного цибриду N. tabacum (+ S. sinuata) та рослини            S. sinuata дикого типу в суміші знаходяться протопласти S. sinuata дикого типу, транспластомні протопласти N. tabacum (+ S. sinuata) та протопласти з ядром S. sinuata і трансформованим пластомом S. sinuata. Для здійснення відбору необхідних протопластів, а саме протопластів з ядром S. sinuata та трансформованим пластомом S. sinuata, необхідно позбутися протопластів інших типів. Розвиткові протопластів N. tabacum (+ S. sinuata) з трансформованим пластомом                S. sinuata запобігали опроміненням рослини перед виділенням протопластів. Протопласти                     S. sinuata дикого типу інактивували додаванням селективного агенту, спектиноміцину. Лінії, відібрані на селективному середовищі (400 мг/л спектиноміцину) могли бути: рослинами S. sinuata з трансформованими пластидами; асиметричними гібридами S. sinuata з трансформованими пластидами та деякою кількістю ядерного матеріалу N. tabacum.
З чотирма рослинами S. sinuata, відібраними на селективному середовищі після проведення соматичної гібридизації транспластомних цибридних рослин N. tabacum (+ S. sinuata) та рослин           S. sinuata дикого типу, був здійснений молекулярний аналіз хлоропластної, мітохондріальної та ядерної ДНК. 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Рис. 3. Результати молекулярного аналізу хлДНК рослин   S. sinuata, отриманих в результаті соматичної гібридизації.

1– 6 - фрагмент між генами trnL та ndhD, ампліфікований за допомогою ПЛР і оброблений рестриктазою EcoRI; 7 - 1 Kb Plus DNA Ladder (Gibco); 8 - 13 - фрагмент, ампліфікований з використанням праймерів, один з яких є специфічним до гену aadA, а другий до ділянки хлДНК; 14 - 20 - фрагмент, ампліфікований з використанням праймерів специфічних до гену aadA; 1 - N. tabacum; 2, 9, 16 - S. sinuata, дикий тип;                      3, 10, 17 - S. sinuata, клон 1; 4, 11, 18 - S. sinuata, клон 2;                                  5, 12, 19 - S. sinuata, клон 3; 6, 13, 20 - S. sinuata, клон 4;               8, 15 - транспластомний цибрид N. tabacum (+ S. sinuata);            14 - позитивний контроль, плазміда рСВ033.

1000

1650

500

Як видно з рисунку 3 (лінії 8 – 13) ПЛР-аналіз відібраних рослин S. sinuata, виконаний з праймерами, один з яких є специфічним до гену aadA, а другий до ділянки хлДНК, підтвердив присутність гена aadA в пластомній ДНК. Рестриктний аналіз ділянки хлоропластного геному між генами trnL і ndhD показав, що рослини містять хлДНК S. sinuata (рис.3; лінії 1 - 6). 
МтДНК вихідних цибридних рослин N. tabacum (+ S. sinuata), які були використані для отримання транспластомних рослин S. sinuata, містила фрагменти, не властиві мтДНК рослин              S. sinuata дикого типу, тобто під час соматичної гібридизації N. tabacum та  S. sinuata цибридними рослинами була успадкована мтДНК як S. sinuata так і N. tabacum (Thanh et al., 1988). У наших експериментах рослини S. sinuata могли отримати мтДНК і від цибриду N. tabacum (+ S. sinuata) і від рослин S. sinuata дикого типу. Тому ми проаналізували гени ndh1, ndh4, ndh5 та ndh7 мтДНК транспластомних рослин S. sinuata, отриманих у наших експериментах. Рестриктний аналіз гена ndh1 показав наявність фрагментів, властивих мтДНК рослин N. tabacum та S. sinuata.
Для перевірки наявності ядерного матеріалу N. tabacum в транспластомних рослинах                     S. sinuata був здійснений ряд аналізів ядерної ДНК. Під час аналізів порівнювали набір фрагментів ядерної ДНК, отриманих за допомогою ПЛР з праймерами 5`- (ТCC)х5 – 3` та набір фрагментів теломерних послідовностей, що синтезувалися з праймерами 5`– (TTTAGGG)х3 – 3` у батьківських рослин та транспластомних рослин S. sinuata. Був також проведений ПЛР-аналіз гена 5S рДНК та рестриктний аналіз з використанням рестриктази DraI ампліфікованих за допомогою ПЛР фрагментів ITS (внутрішній спейсер, що транскрибується; від англ. internal transcribed spacer). Додатково до ПЛР- та рестриктного аналізів досліджували спектри множинних молекулярних форм амілаз та естераз, які також не показали наявності ядерного матеріалу N. tabacum в транспластомних рослинах  S. sinuata. 
Результати аналізу транспластомних рослин S. sinuata отриманих у результаті соматичної гібридизації транспластомних цибридних рослин N. tabacum (+ S. sinuata) та рослин S. sinuata дикого типу показали, що рослини містять хлоропластну ДНК S. sinuata з вбудованим геном aadA. МтДНК рослин S. sinuata успадкована від рослин N. tabacum та S. sinuata. ПЛР-, рестриктний аналізи ядерної ДНК та дослідження множинних молекулярних форм амілаз та естераз не виявили ядерного матеріалу N. tabacum в транспластомних рослинах S. sinuata. 
Використання трансгенних пластид Nicotiana tabacum в експериментах із соматичної гібридизації. Для цієї серії експериментів була використана векторна конструкція pICF584, яка крім селективного гена aadA містила ще і репортерний ген uidA, що кодує -глюкуронідазу. Використання репортерного гена uidA (продукт експресії якого легко ідентифікується за специфічною реакцією з 5-бромо-4-хлоро-3-індоліл--D-глюкуронідазою) дає додаткові можливості для дослідження експресії трансгену на різних етапах розвитку рослинних клонів та в різноманітних тканинах і органах. 
Спершу, використовуючи методику хлоропластної трансформації, описану в статті Koop et al., 1996, здійснили трансформацію рослин тютюну, отримавши рослини, які в хлоропластному геномі містять селективний ген aadA та репортерний ген uidA. Наступним етапом було перенесення трансформованих хлоропластів з транспластомних рослин тютюну до рослин іншого виду за допомогою соматичної гібридизації. Реципієнтами трансгенних пластид тютюну були обрані рослини L. barbarum, дикого представника родини пасльонових. Ці рослини мають їстівні плоди та здавна застосовуються людиною в медицині. Їх також часто використовують як декоративні рослини. Зацікавленість рослинами L. barbarum пов’язана з потенційною можливістю їх використання для створення їстівних вакцин. Такий альтернативний спосіб уведення вакцин в організм людини обговорюється в літературі саме в зв’язку з розвитком технології пластидної трансформації (Daniell et al., 2001). 
Для отримання рослин з ядром L. barbarum та пластомом N. tabacum ядро клітин тютюну інактивували шляхом опромінення рослин гамма-променями перед виділенням протопластів. Отримані на селективному середовищі рослини могли бути також асиметричними гібридами з частиною ядерного матеріалу тютюну в рослинах L. barbarum. У результаті експериментів було відібрано 7 зелених колоній. Шість із них втратили зелене забарвлення і припинили ріст протягом кількох місяців культивування на селективному середовищі (300 мг/л спектиноміцину), а одна продовжувала рости і залишалася зеленою. Відібрана зелена колонія почала регенерувати через 8 місяців культивування на регенераційному селективному середовищі (300 мг/л спектиноміцину). Було отримано 5 регенерантів. Усі регенеранти мають насичений зелений колір і за морфологією подібні до рослин  L. barbarum дикого типу (рис.4).

Рис. 4. Порівняння морфології рослини         L. barbarum дикого типу (А) та рослини, отриманої в результаті соматичної гібридизації транспластомної рослини                N. tabacum і рослини L. barbarum (В). 

A

B

Транспластомні рослини тютюну, використані для соматичної гібридизації, містили ген uidA, продукт експресії якого, -глюкуронідаза, виявляється за специфічним синім забарвленням під час гістохімічної реакції. Листки рослин-регенерантів, отриманих в результаті соматичної гібридизації, також забарвлюються в синій колір під час гістохімічного аналізу, що свідчить про активність гена uidA в рослинах-регенерантах (рис.5).

Рис. 5. Аналіз активності гена uidA в тканинах листків рослини, отриманої в результаті соматичної гібридизації транспластомної рослини N. tabacum і рослини L. barbarum. А – контроль, лист рослини L. barbarum дикого типу; В -  лист рослини, отриманої в результаті соматичної гібридизації.

В

А

 ПЛР-аналіз з праймерами, специфічними до гену aadA, підтвердив наявність гена aadA в клітинах відібраної колонії. Для дослідження природи хлоропластної ДНК колонії, отриманої в результаті соматичної гібридизації, був виконаний порівняльний аналіз рестриктних спектрів ампліфікованого за допомогою полімеразної ланцюгової реакції фрагменту trnL-ndhD хлДНК. Для виявлення можливої гібридної природи ядерного геному відібраної  колонії, отриманої в результаті соматичної гібридизації був проведений ПЛР-аналіз з праймерами, специфічними до гену 5S рДНК. Аналізи показали, що колонія містить пластидну ДНК тютюну, та ядерну ДНК                L. barbarum. 
Заключне слово і перспективи. Запропонований нами підхід дає можливість отримувати пластидні трансформанти видів, які мають низький регенераційний та трансформаційний потенціал. Звісно, підхід має певні обмеження і потребує детальнішої розробки. До недоліків можна віднести велику кількість етапів виконання, що потребує багато часу, а також, збільшення імовірності виникнення порушень, пов’язаних із сомаклональною мінливістю. У даній роботі, в основному, використовувалися модельні та дикі представники родини пасльонових. Ми сподіваємося на успішне продовження розпочатої роботи з іншими видами рослин та з іншими векторними конструкціями і трансгенами. 
Загалом підхід дозволяє: підвищувати ефективність трансформації пластомної ДНК видів з низьким трансформаційним потенціалом; створювати марковані пластоми та з їх допомогою вести пошук нових сумісних ядерно-цитоплазматичних комбінацій; досліджувати вплив ядра на процеси, що відбуваються в пластомі, вивчати ядерно-цитоплазматичні взаємовідносини.  

ВИСНОВКИ
1. Запропоновано та розроблено новий підхід до здійснення пластидної трансформації. Підхід полягає в перенесенні пластид від рослини, що цікавить, до рослини-посередника (рослини з високою регенераційною здатністю), трансформації пластид та їх зворотньому перенесенні. 
2.  Показана можливість генетичної трансформації пластому хлоропластів, що функціонують в клітинах інших видів. 
3.  Вперше отримано хлоропластні трансформанти цибридних рослин Nicotiana tabacum      (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaina оfficinalis) та Nicotiana tabacum                       (+ Salpiglossis sinuata). 
4. Отримано хлоропластні трансформанти Salpiglossis sinuata за допомогою соматичної гібридизації між транспластомними рослинами Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) та рослинами Salpiglossis sinuata дикого типу. 
5.  Молекулярнo-біологічний аналіз транспластомних рослин Salpiglossis sinuata показав, що вони мають ядерну та пластидну ДНК Salpiglossis sinuata, а мітохондріон успадкували від  Nicotiana tabacum та Salpiglossis sinuata.
6. Отримано трансформанти Nicotiana tabacum з селективним геном aadA та репортерним геном uidA, що експресуються в хлоропластах.
7.  Показана можливість отримання гібридної рослини в результаті соматичної гібридизації транспластомної рослини Nicotiana tabacum з генами uidA та aadA, вбудованими в хлоропластний геном та рослини Lycium barbarum дикого типу. На селективному середовищі була відібрана одна зелена колонія, з якої було отримано п’ять регенерантів. Листові тканини рослин-регенерантів експресують ген uidA. 
8.  Молекулярно-біологічний аналіз колонії, отриманої в результаті соматичної гібридизації транспластомної рослини Nicotiana tabacum та рослини Lycium barbarum дикого типу, показав, що хлоропластний геном колонія отримала від Nicotiana tabacum, ген aadA присутній в пластомі, а в ядерній ДНК не виявлено генетичного матеріалу Nicotiana tabacum. Отже, показано, що ядро Lycium barbarum та пластом Nicotiana tabacum можуть спільно функціонувати.

CПИСОК  РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Ситник К.С.,  Кучук М.В. Отримання транспластомних рослин Salpiglossis sinuata //  Науковий вісник НАНУ. – 2003. - Т. 65. - С. 52 – 55.
2. Сытник Е.С., Парий А.Ф., Комарницкий И.К., Глеба Ю.Ю., Кучук Н.В. Анализ ядерного и митохондриального геномов у транспластомных растений Salpiglossis sinuata, полученных путем переноса трансформированных пластид от цибрида N. tabacum (+ S. sinuata) // Цитология и генетика. – 2003. -  Т. 37. - № 5. -  С. 3 – 8.
3. Ситник К.С., Комарницький І.К., Глеба Ю.Ю., Кучук М.В. Генетична трансформація пластомів цибридних рослин Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica) та Nicotiana tabacum                       (+ Physochlaine officinalis) // Український ботанічний журнал. -  2003. -  Т. 60. -  № 5. - С. 517 – 522.
4. Sytnik E., Vasilenko M., Komarnitsky I., Kuchuk N. Plastid transformation of cybrid plants carreing Nicotiana tabacum nuclear genome and plastomes of Scopolia carniolica, Lycium barbarum, Physochlaine officinalis and Salpiglossis sinuata // Abstracts of the conference “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources”. – Yalta. - 2002. – C. 77.
5. Сытник Е.С., Бреус О.С. Получение пластомных трансформантов растений Salpiglossis sinuata // Сборник тезисов 2 – ой международной конференции молодых ученых “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений”. – Харьков. – 2003. – C.94.
6. Сытник Е.С., Бреус О.С., Кучук Н.В. Пластомная трансформация цибридных растений // Сборник тезисов IV Международной конференции “Геном растений”. – Одесса. - 2003. – C. 75.
7. Sytnik E., Breus O. Plastid transformation of cybrid plants // Abstract book of the Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. -  Kyiv. - 2003. – C. 34.
8. Ситник К.С., Комарницький І.К. Отримання рослин Lycium barbarum з генетично зміненим пластомом Nicotiana tabacum // Тези доповідей Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології. – Львів. – 2004. - С. 99.

АНОТАЦІЯ
Ситник К.С. Розробка модельної системи отримання транспластомних рослин на прикладі представників родини пасльонових.– Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2004.
В дисертаційній роботі запропоновано та розроблено новий підхід для здійснення пластидної трансформації. Підхід полягає в створенні за допомогою соматичної гібридизації цибридних рослин з ядром рослини, яка має високу регенераційну здатність та пластидами рослини, що цікавить, але має низьку регенераційну та трансформаційну здатність; генетичній трансформації пластид та зворотньому їх перенесенні в клітини того ж виду, до якого належать пластиди або до іншого виду, ядро якого є сумісним з даним пластомом.
На першому етапі роботи за допомогою методу обробки протопластів поліетиленгліколем векторною плазмідою з селективним геном aadA (аминоглікозид 3`- аденілінтрансфераза), оточеним гомологічними послідовностями хлДНК, виконали трансформацію хлДНК отриманих раніше цибридних рослин Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum                           (+ Physochlaine officinalis) та Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata). Трансформовані рослини відбирали на селективному середовищі зі спектиноміцином. Другий етап полягав в перенесенні трансгенних пластид Salpiglossis sinuata з цибридної рослини до рослин Salpiglossis sinuata дикого типу. В наступній серії експериментів векторною конструкцією з селективним геном aadA та репортерним геном uidA (ген -глюкуронідази) здійснили хлоропластну трансформацію рослин тютюну та перенесли трансгенні пластиди тютюну в рослини Lycium barbarum.
Ключові слова: тютюн, пасльонові, цибрид, протопласт, пластидна трансформація, соматична гібридизація, ген аминоглікозид 3`- аденілінтрансферази, ген -глюкуронідази.

АННОТАЦИЯ
Сытник Е.С.  Разработка модельной системы получения транспластомных растений на примере представителей семейства паслёновых. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2004.
В диссертационной работе предложен и разработан новый подход к осуществлению пластидной трансформации. Подход состоит в создании с помощью соматической гибридизации цибридных растений с ядром растений имеющих высокую регенерационную способность и пластидами интересующих растений, но имеющих низкую регенерационную и трансформационную способность; генетической трансформации пластид созданных цибридных растений и переносе их в клетки того же вида, которому принадлежат пластиды или в клетки другого вида, ядро которого совместимо с данным пластомом. 
На первом этапе экспериментов с помощью метода обработки протопластов полиэтиленгликолем выполнили трансформацию хлДНК ранее созданых цибридных растений Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis) и Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata). Трансформацию осуществляли векторной конструкцией с селективным геном aadA (ген аминогликозид-3`-аденилтрансферазы), окруженным гомологическими последовательностями хлДНК ( геном rpl32 (рибосомальный белок) и геном trnL (тРНК лейцина) малой уникальной области пластома табака), что обеспечивает встраивание трансгена в определенную область пластома. 
Второй этап экспериментов состоял в переносе с помощью соматической гибридизации трансгенных пластид из цибридных растений Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) в растения  Salpiglossis sinuata дикого типа. Для отбора необходимых продуктов слияния (растений с ядром Salpiglossis sinuata и трансгенным пластомом Salpiglossis sinuata) развитие одного из родителей, донора хлоропластов (транспластомное цибридное растение Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata)) инактивировали облучением -лучами в дозе 500 – 600 Гр (источник - Со60, 0,1 Гр/сек). Деление протопластов второго родителя, растения Salpiglossis sinuata дикого типа, предотвращали добавлением в питательную среду селективного антибиотика спектиномицина. 
С четырьмя отбранными на селективной среде растениями был осуществлен молекулярно-биологический анализ ядерной, хлоропластной и митохондриальной ДНК. Анализ подтвердил присутствие трансгена в пластоме отобранных растений,  показал, что растения имеют пластом Salpiglossis sinuata, а митохондриальная ДНК унаследована как от растений N. tabacum так и от растений S. sinuata. ПЦР-анализ и рестриктный анализ ряда областей ядерной ДНК, а также анализ множественных молекулярных форм ферментов амилазы и эстеразы показал, что во всех случаях фрагменты ДНК транспластомных растений S. sinuata идентичны тем, которые синтезируются с ДНК растений S. sinuata дикого типа и отличаются от фрагментов табака. 
В следующей серии экспериментов получили транспластомные растения табака и перенесли с помощью соматической гибридизации трансгенные хлоропласты табака в растения Lycium barbarum. Для этих експериментов использовали векторную конструкцию с селективным геном aadA и репортерным геном uidA (ген -глюкуронидазы). Гены находяться между последовательностями psbA (D1 белок фотосистемы ІІ) и trnH (тРНК гистидина) большой уникальной области пластома табака. В результате экспериментов была отобрана одна колония, которая через восемь месяцев культивирования на регенерационной селективной среде дала пять регенерантов. Морфологически растения-регенеранты похожи на растения Lycium barbarum дикого типа. Молекулярно-биологический анализ колонии показал, что ген aadA присутствует в пластоме, пластиды унаследованы от табака, а ядро – от Lycium barbarum. Гистохимический анализ активности гена -глюкуронидазы в тканях листа дал специфическую синюю окраску, что подтверждает наличие экспрессии uidA гена.
Ключевые слова: табак, паслёновые, цибрид, протопласт, пластидная трансформация, соматическая гибридизация, ген аминогликозид-3`-аденилтрансферазы, ген -глюкуронидазы.

SUMMERY
Sytnyk K.S. Development of model system of transplastomic plants receiving by the example of Solanaceae family representatives.- Manuscript.
Thesis for a PhD degree (Biology) by speciality 03.00.20 – biotechnology. – Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.
The thesis is devoted to development of a new approach to recalcitrant species plastid transformation. We studied plastid transformability of remote cytoplasmic hybrids (cybrids) that combine nucleus of tobacco, an easily transformable species, and plastids of other, recalcitrant Solanaceae species. In such experiments tobacco cells used as a transformable intermediary host. In present work, we carried out genetic transformation of plastids of cybrid Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum (+ Physochlaine officinalis) and Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) plants. The vector plasmid that contains selective aadA gene (aminoglycoside 3`-adenylyntransferase) flanked by rpl32 (ribosomal protein) and trnL (tRNA-Leu) genes of tobacco plastome for targeting aadA gene to this specific region of chloroplast genome was used. Second stage of our experiments was transferring by somatic hybridization Salpiglossis sinuata transgenic chloroplasts from cybrid plants to wild type Salpiglossis sinuata plants.
The next series of our experiments consists in creation of transplastomic tobacco plants and transferring by somatic hybridization transgenic tobacco plastids to Lycium barbarum plants. For these experiments vector plasmid that contains selective aadA gene and reporter uidA (gene that encode -glucuronidase) was used. 
Key words: tobacco, Solanaceae, cybrid, protoplast, plastid transformation, somatic hybridization, aminoglycoside 3`-adenylyntransferase, -glucuronidase.