Публікація:Моргун Б.В. и др. (2014) Молекулярные биотехнологии по повышению устойчивости культурных злаков к осмотическим стрессам
Моргун Б.В., Тищенко Е.Н. Молекулярные биотехнологии по повышению устойчивости культурных злаков к осмотическим стрессам : [монографія] – К.: Логос, 2014. – 221 с. – Бібліогр.: с. 188–220. ISBN 978-966-171-887-5;
УДК 577:606:633.11; ББК 28.070+28.54; М79
В монографии рассмотрено современное состояние молекулярных биотехнологий, направленных на повышение уровня устойчивости культурных злаков к осмотическим стрессам. Проанализирована перспективность использования генов транскрипционных факторов и структурных генов, связанных со стресс-устойчивостью. Значительное внимание уделено теоретическим и практическим вопросам генетической трансформации растений in vitro и in planta. Обсуждены эпигенетические вопросы трансгенеза, в том числе касающиеся разработки siPHK-технологий. Представлены результаты физиолого-биохимических аспектов молекулярных биотехнологий, связанных с синтезом запасных веществ.
Для генетиков, биотехнологов, молекулярных биологов, физиологов растений, студентов, преподавателей ВУЗов.
В монографії розглянуто сучасний стан молекулярних біотехнологій, спрямованих на підвищення рівня стійкості культурних злаків до осмотичних стресів. Проаналізована перспективність використання генів транскрипційних факторів та структурних генів, пов’язаних із стрес-стійкістю. Значна увага приділена теоретичним і практичним питанням генетичної трансформації рослин in vitro і in planta. Обговорені епігенетичні питання трансгенеза, в тому числі ті, що стосуються розробки нових siPHK-технологій. Надані результати фізіолого-біохімічних аспектів молекулярних біотехнологій, пов’язаних із синтезом запасних речовин.
Рецензенты: Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент НАН Украины В.А. Кунах и доктор биологических наук, профессор Т.В. Чугункова.
Утверждено к печати ученым советом Института физиологии растений и генетики НАН Украины.
СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений ... 5
Предисловие ... 8
Глава 1. Перспективность применения транскрипционных факторов для повышения уровня устойчивости культурных растений к абиотическим стрессам ... 13
1.1. DREB-субсемейство ... 15
1.2. AREB/ABF-субсемейство ... 34
1.3. NAC-субсемейство ... 48
1.4. MYB-субсемейство ... 58
1.5. WRKY-субсемейство ... 65
1.6. Субсемейства NF-Y, ERF, Zn-фингер, Cys2/His2-типа ... 69
Глава 2. Структурные гены, связанные с процессами адаптации/устойчивости культурных злаков к водному дефициту и засолению ... 77
Глава 3. Agrobacterium-опосредованная трансформация культурных растений ... 111
3.1. Молекулярно-генетические аспекты взаимодействия агробактерий с клетками растений ... 113
3.2. Интеграция рекомбинантных молекул ДНК и уровень изменчивости генома растений ... 117
3.3. Гомолого-зависимое молчание трансгенов ... 126
Глава 4. Agrobacterium-опосредоанная трансформация кукурузы in vitro ... 135
4.1. Agrobacterium-опосредованная трансформация кукурузы с использованием в качестве эксплантов незрелых зародышей ... 136
4.2. Agrobacterium-опосредованная трансформация инбредных линий кукурузы с использованием в качестве эксплантов сегментов побегов, содержащих апикальные меристемы ... 141
4.3. Биолистическая трансформация кукурузы ... 147
Глава 5. Agrobacterium-опосредованная трансформация кукурузы in planta ... 151
5.1. Способы Agrobacterium-опосредованной трансформации растений in planta ... 151
5.2. Agrobacterium-опосредованная трансформация кукурузы in planta ... 152
5.3. Идентификация трансгенных растений кукурузы с комплексной устойчивостью к гербицидам и насекомым ... 158
Глава 6. Физиолого-биохимические аспекты Agrobacterium-опосредованной трансформации кукурузы in planta ... 164
6.1. Спектры полипептидов белков и содержание углеводов в зерновках трансгенных растений кукурузы ... 164
6.2. Метаболизм сахарозы при Agrobacterium-опосредованной трансформации кукурузы ... 167
6.2.1. Изменения в функционировании энзимов метаболизма сахарозы в гетеротрофных тканях растений кукурузы, трансформированной in planta штаммами LBA4404 (pBi2E) и GV2260 (рСВ002) ... 169
6.2.2. Изменения в функционировании энзимов метаболизма сахарозы в эндосперме последующего поколения растений кукурузы, трансформированной in planta штаммами LBA4404 (pBi2E) и GV2260 (рСВ002) ... 173
6.3. Гени, детерминирующие качественные характеристики зерна кукурузы ... 178
Заключение ... 182
Conclusion ... 187
Список литературы ... 188
ПРЕДИСЛОВИЕ
Основой современного сельскохозяйственного производства является создание высокопродуктивных сортов и гибридов культурных злаков с повышенным уровнем устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды, среди которых осмотические стрессы оказывают наибольший негативный эффект на их рост, развитие, и в конечном итоге на продуктивность.
Наряду с традиционными методами селекции в последние десятилетия интенсивно стали разрабатываться молекулярные биотехнологии, направленные на получение новых форм путём интеграции в геном культурных злаков рекомбинантных молекул ДНК, способных на генетическом уровне контролировать процессы адаптации/устойчивости. Успешному технологическому решению этих вопросов способствует прогресс, достигнутый в последнее десятилетие в области фундаментальных исследований структурно-функциональной геномики, теоретических и практических аспектов Agrobacterium-опосредованной и биолистической трансформации кукурузы, пшеницы, риса, ячменя.
Молекулярно-генетические исследования показали, что в ответ на осмотические стрессы реализуются генетические программы, которые сопровождаются дифференциальной экспрессией генов разнообразных функций, в том числе связанных с устойчивостью к водному дефициту, засолению, экстремальным температурам. В целом, эти гены классифицируют на две основные группы. Одна из них представляет гены, продукты которых принимают непосредственное участие в физиолого-биохимических процессах, связанных с повышением уровня стрессоустойчивости. Другая группа имеет отношение к генам транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию первых. Более того, в перекрестных путях передачи сигналов в ответной реакции растений на разные типы абиотических стрессов могут принимать участие регуляторные и структурные гены аналогичных функций, что позволяет растениям оптимально реагировать на изменяющиеся условия окружающей среды и поддерживать свою жизнеспособность.
Ключевое положение при разработке молекулярных биотехнологий занимает идентификация регуляторных или структурных генов, которые могут эффективно контролировать процессы адаптации/устойчивости культурных злаков на разных этапах их развития. Перспективность их использования определяется всесторонним анализом трансгенных растений и их семенного поколения по генетическим, физиолого-биохимическим, морфологическим показателям, по показателям урожайности/продуктивности как в контролируемых вегетационных исследованиях под влиянием различных стрессовых факторов, так и в естественных условиях культивирования in vivo.
Гены, рассматриваемые в качестве возможных кандидатов, способных приводить к повышению уровня адаптации/устойчивости растений к неблагоприятным факторам окружающей среды, классифицируют на несколько основных категорий. Значительный интерес вызывают гены стресс-реагируемых транскрипционных факторов, которые принадлежат к разнообразным семействам и субсемействам: AP2/ERF, NAC, MYB, MYC, bZIP, NF-Y, Cys2His2 zinc-finger, WRKY (гл. 1). Анализируются возможности широкого ряда структурных генов, связанных, в частности, с метаболизмом осмотических веществ, биосинтезом молекулярных шаперонов, белков позднего эмбриогенеза, протеинкиназ, фитогормонов (гл. 2). На этом пути достигнут значительный прогресс.
Другая сторона молекулярных биотехнологий культурных злаков связана с разработкой эффективных методов переноса рекомбинантных молекул ДНК в клетки, их интеграции в ядерный геном и стабильной экспрессии в последующих поколениях. Среди них Agrobacterium-опосредованная и биолистическая трансформация – два основных способа, которые используются для получения коммерческих биотехнологических растений (гл. 3). Особый интерес вызывает первый из них в связи с преимущественной интеграцией трансгенов в транскрипционно-активные области ядерного генома и возможностью интеграции рекомбинантных молекул ДНК, несущих информацию о генах, кодирующих несколько признаков.
Вместе с тем, использование обеих этих способов интеграции экзогенной ДНК может приводить к трудно прогнозируемым последствиям, связанным с изменениями в структурно-функциональной организации генома растений в процессах их роста и развития. В связи с этим продолжаются исследования многих аспектов фундаментальных вопросов трансгенеза, углублённое понимание которых способствует решению практических задач по получению биотехнологических растений с заданными признаками (гл. 3, 4). В последние годы наряду с генетической трансформацией в системе in vitro всё больший интерес вызывает разработка экономически выгодных и надёжных способов in planta (гл. 5).
С использованием разных способов генетической трансформации растений возможно встраивание единичных и множественных копий рекомбинантных молекул. При получении линий трансгенных растений предпочтение отдаётся генетически модифицированным вариантам, в геном которых интегрированы единичные гомологичные копии трансгенов в связи с большей вероятностью стабильного их наследования и экспрессии в последующих поколениях. Ситуация осложняется тем, что через несколько поколений может происходить сайленсинг даже единичных рекомбинантных молекул, однако частота таких изменений является существенно меньшей по сравнению с трансгенами, представленными множественными копиями. Считается, что стабильность и уровень экспрессии трансгенов зависит от многих факторов, в том числе структуры трансгенного локуса, позиции интеграции, числа интегрированных копий трансгена.
Важный аспект нестабильного функционирования рекомбинантных молекул ДНК связан с эпигенетической регуляцией через репрессию генов – фундаментальным процессом, в результате которого селективно изменяется их экспрессия. Одно из ключевых направлений трансгенеза связано с гомолого-зависимым сайленсингом генов (HDGS), реализуемом на транскрипционном (TGS) и посттранскрипционном (PTGS) уровнях. При TGS промоторы трансгенов теряют способность запускать транскрипцию трансгенов, тогда как при PTGS осуществляется транскрипция, однако в цитоплазме мРНК подвергаются деградации. TGS наследуется митотически и мейотически, тогда как эффект PTGS может сниматься при мейозе. Трансгены могут становиться эпигенетически молчащими сразу, или же спустя короткий или даже длительный период экспрессии в ряду поколений. Такое явление имеет отношение не только к интродуцируемым трансгенам, но и к гомологичным им растительным генам. TGS и PTGS, направленные на один и тот же конечный результат – инактивацию чужеродной генетической информации, могут проходить через взаимосвязанные этапы посредством коротких двуцепочечных РНК (siRNA).
Понимание молекулярных основ биогенеза коротких РНК размером 21-25 п.н., их функции как возможных регуляторных молекул в генетическом уровне контроля адаптации/устойчивости растений привело к разработке нового направления генетической инженерии – siRNA-технологиям. При этом осуществляется целенаправленное изменение экспрессии эндогенных генов, принимающих участие в молекулярно-генетических механизмах ответной реакции на осмотический стресс, и в конечном итоге к повышению уровня устойчивости трансгенных растений к водному дефициту и засолению. Экспериментальные обоснования эффективности siRNA-технологий для растений, в том числе и культурных злаков ограничены. В исследованиях, проводимых в Институте физиологии растений и генетики НАН Украины с использованием двухцепочечного РНК-супрессора гена пролиндегидрогеназы, любезно предоставленного коллегами из Института цитологии и генетики СО РАН, разрабатываются технологии метаболической инженерии для повышения уровня осмотолерантности кукурузы, пшеницы, подсолнечника. Эффективность такого направления исследований обоснована для трансгенных растений кукурузы, повышенный уровень устойчивости которых к водному дефициту и засолению сопряжён со значительной аккумуляцией осмолита – свободного L-пролина (гл. 2).
Один из важных фундаментальных и прикладных вопросов трансгенеза касается особенностей физиолого-биохимических процессов биотехнологических растений. Основное наше внимание было обращено на экспрессию генов запасных белков и метаболизм углеводов кукурузы, относящейся к крахмалсодержащим растениям, что предопределяет целесообразность разработки этих вопросов при получении её трансгенных растений (гл. 6).
В данной монографии рассмотрено современное состояние вопросов, связанных с теоретическими и прикладными аспектами молекулярных биотехнологий, касающихся перспективности использования ряда регуляторных и структурных генов для получения культурных злаков с повышенным уровнем устойчивости к осмотическим стрессам. Авторы отчетливо понимают сложность написания монографии на указанную тему в связи с многогранностью теоретических вопросов, многие из которых далеки от полного понимания, разнообразием технологических решений по получению трансгенных растений хозяйственно-ценных культурных злаков. В монографии представлены результаты исследований, проводимых в отделе генетической инженерии Института физиологии растений и генетики НАН Украины и в отделе молекулярной генетики Института клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины. Надеемся, что она будет полезна для понимания фундаментальных основ трансгенеза, для оптимизации условий генетической трансформации и отбора биотехнологических растений с улучшенными физиолого-биохимическими показателями.
